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蛋白质

蛋白质介绍资料

 

一、什么是蛋白质?

蛋白质是由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链,再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物,是构成人体组织器官的支架和主要物质,在人体生命活动中,起着重要作用。蛋白质中一定含有碳、氢、氧、氮元素,氨基酸通过脱水缩合连成肽链,是组成蛋白质的基本单位。

蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种基本氨基酸,在蛋白质中,某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化,从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质可以一起,往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物,折叠或螺旋构成一定的空间结构,从而发挥某一特定功能。合成多肽的细胞器是细胞质中糙面型内质网上的核糖体。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类、数目、排列顺序和肽链空间结构的不同。

在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下,蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来.这种凝结是不可逆的,不能再使它们恢复成原来的蛋白质.蛋白质的这种变化叫做变性.蛋白质变性之后,紫外吸收,化学活性以及粘度都会上升,变得容易水解,但溶解度会下降。蛋白质变性后,就失去了原有的可溶性,也就失去了它们生理上的作用。因此蛋白质的变性凝固是个不可逆过程。

引起蛋白质变性的主要因素有:①温度。②酸碱度。③有机溶剂。④脲和盐酸胍。⑤去垢剂和芳香环化合物。

蛋白质的变性常伴随有下列现象:生物活性的丧失。这是蛋白质变性的最主要特征。化学性质的改变。物理性质的改变。在变性因素去除以后,变性的蛋白质分子又可重新回复到变性前的天然的构象,这一现象称为蛋白质的复性。蛋白质的复性有完全复性、基本复性或部分复性。只有少数蛋白质在严重变性以后,能够完全复性。

二、蛋白质聚集

1.蛋白质聚集的原因及危害:

生物蛋白在生产过程中主要经历三个步骤:

    蛋白质的合成和纯化;

②运输过程中为稳定蛋白性质进行冷冻干燥;

    蛋白注射前的重组。

为保护蛋白药物的稳定性,防止其变性和丢失生物活性,需将制剂在低温下使其所含的水分冻结,然后放在真空的环境下干燥,让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从制品中排除而使制品活性干燥。在使用前加水,复溶重组,使粉末能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。冻干后的蛋白质在重组过程中易发生聚集,产生大颗粒,降低生物药活性及药品中蛋白单体浓度,诱导人体产生抗药物抗体(ADAs),产生有害的毒理学作用和免疫应答,甚至会引起过敏反应,威胁生命安全。

2.蛋白质聚集的检测方法

1)显微镜法—

在电子显微镜或光学显微镜下观测聚集体粒子,通过检测等效投影面积直径,即与实际检测颗粒投影面积相同的球形颗粒的直径,在对数坐标下,分析聚集体中单粒子的数量与大小的关系来确定分数维数,常用的检测方法包括原子力显微镜和激光共聚焦显微镜。

2)分析测量法—

分析测量法最主要的特点是有试样分离过程,代表性的包括尺寸排阻色谱法和非变性凝胶电泳法。此外,消减尺寸排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等也用在蛋白质凝聚过程分析中。

3)散射法—

散射法通常包括光散射、中子散射和X射线散射。光散射法适用蛋白质聚集体粒子尺寸约从50nm到几个μmX射线及中子散射法适用的蛋白质聚集粒子尺寸通常小于20nm。比较常用的包括静态光散射法(SLS法)、动态光散射法(DLS法)和扩散波谱法等。

3. 蛋白质的应用

蛋白质在医药、食品、日用化妆品等领域均已有大量应用。其中在医药行业中的蛋白注射剂已经成为重要的一个给药剂型。

4. 药用蛋白的质量标准

蛋白的给药途径不同,其质量要求也各不相同,很难制定统一的质量标准。但对所制备的蛋白质的质量必须有最基本的评定。

现在判断蛋白质质量的一个重要指标是粒径大小分布。蛋白质药物的一个重要缺陷是稳定性差。在生产、纯化、运输和储存等过程中,极易因环境和自身稳定性等因素发生部分肽段解折叠、氨基酸残基氧化和二硫键断裂等,最终都可能导致其团聚,形成大粒子,影响患者生命安全。所以对蛋白质药物的团聚程度进行检测是生物制药的重要环节。

美国药典<USP>对蛋白注射剂中的颗粒数目做了明确的规定,参见<USP787>。其中介绍了两种测试粒径的方法,常用光阻法。

<USP787>中阐述:在每瓶蛋白质注射制剂中,若注射剂容积≤100ml,则每瓶中的粒径≥10μm的颗粒总数不得超过6000个,粒径≥25μm的颗粒总数不得超过600个,若注射剂容积>100ml,则不仅需满足上述需求,还需同时满足每毫升粒径≥10μm的颗粒数目不得超过25个,粒径≥25μm的颗粒数目不得超过3个。

四、粒度检测解决方案

美国PSS可以提供蛋白粒度检测问题的最优化方案,从整体粒径分布到团聚体大颗粒计数全套检测方案一步到位。

测试平均粒径分布的仪器型号有:

Nicomp 380 N3000 Z3000

测试大颗粒浓度的仪器型号有:

AccuSizer 780 A2000 SIS FXNano SIS.

详情如下:

(1)    粒径分布—Nicomp 380 Z3000


Z3000测试未过滤的免疫球蛋白,在200-500nm处有峰出现,表明此蛋白已经团聚,需进一步测试团聚体的浓度。

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(2)    颗粒计数—Accusizer 780 A9000 FXNano SIS


FXNano SIS测试球蛋白样品浓度,和上述Z3000的测试结果相对应,样品在200-500nm处确实已经团聚,浓度高达108#/ml。

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(3)    颗粒计数—Accusizer 780 A2000 SIS

PSS现役法规软件可直接给出符合USP<787>药典要求的测试报告,并有效帮助客户判断是否通过标准。

 

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